プロテインA ELISAキットの性能概要
はじめに
プロテインA ELISAキット（カタログ番号 9000-1）は、残留ネイティブおよび組み換えプロテインA（rPA）の検出と定量を目的としています。当社のプロテインA ELISAキットは、抗体製品に混入する微量のプロテインAを高感度で測定する必要があるお客様向けに開発されました。プロテインAの汚染検査は、開発段階および商業生産段階の複数の段階で実施されます。具体的には、以下の段階が含まれます。
- 特定の条件下での樹脂の浸出特性に関するプロセス開発
- 製造、通常は精製プロセスの複数のポイントで採取した溶出サンプルから
- プロセスの封じ込めレベルとロット間の一貫性を文書化するために製品リリースを完了する
以下のサマリーレポートには、ヒト免疫グロブリンG（hIgG）存在下でのProtein A ELISAキットの評価から収集された性能データが含まれています。ここに示すデータは、Protein A ELISAキットの以下の性能を実証しています。
- PBS-T緩衝液中の最大0.5 mg/mlのhIgG存在下でrPAを検出する能力
- 回収率（精度）、アッセイ間およびアッセイ内精度、定量限界および検出限界
結果の概要
hIgG存在下でのrPA
プロテインA ELISAキットの性能は、hIgG存在下でrPAを検出した場合と、hIgGを含まない標準液と比較した場合で評価されました。rPAを添加したすべてのサンプルのhIgG最終濃度は0.125 mg/mlでした（アッセイプレートへの最終希釈後）。各サンプルは8回繰り返し調製し、キットの標準プロトコルに従ってXNUMX回のELISAを実施しました。
データ処理
標準曲線のデータポイントは4パラメータフィット分析に当てはめられました。この式により、サンプル中のrPA濃度の逆算とLoQ値の算出が可能になりました。回収率は以下のように計算されました。
アッセイ内精度
表1. 標準曲線サンプルのアッセイ内精度（hlgGなし）
| 濃度（ng/ml） | 平均%CV |
|---|---|
| 1.6 | 3.7 |
| 0.8 | 3.5 |
| 0.4 | 4.7 |
| 0.2 | 6.8 |
| 0.1 | 4.6 |
| 0.05 | 8.6 |
表2. hIgGを含むサンプルのアッセイ内精度
| 濃度（ng/ml） | 計算された濃度 | 平均%CV |
|---|---|---|
| 1.2 | 1.08 | 3.9 |
| 1.0 | 0.91 | 3.5 |
| 0.8 | 0.74 | 2.6 |
| 0.6 | 0.54 | 3.9 |
| 0.4 | 0.35 | 3.4 |
| 0.2 | 0.19 | 8.7 |
| 0.1 | 0.11 | 10.4 |
| 0.05 | 0.06 | 17.7 |
アッセイ間精度
表3. 標準曲線サンプルのアッセイ間精度（hlgGなし）
| 濃度（ng/ml） | 平均%CV |
|---|---|
| 1.6 | 3.3 |
| 0.8 | 3.2 |
| 0.4 | 4.9 |
| 0.2 | 1.6 |
| 0.1 | 4.1 |
| 0.05 | 2.1 |
表4. hIgGを含むサンプルのアッセイ間精度
| 濃度（ng/ml） | 計算された濃度 | 平均%CV |
|---|---|---|
| 1.2 | 1.08 | 1.3 |
| 1.0 | 0.91 | 0.9 |
| 0.8 | 0.74 | 0.8 |
| 0.6 | 0.54 | 0.4 |
| 0.4 | 0.35 | 1.0 |
| 0.2 | 0.19 | 3.1 |
| 0.1 | 0.11 | 4.9 |
| 0.05 | 0.06 | 5.1 |
精度
表5. 標準曲線サンプルの精度
| 濃度（ng/ml） | 平均回復率 |
|---|---|
| 1.6 | 100 |
| 0.8 | 100 |
| 0.4 | 100 |
| 0.2 | 101 |
| 0.1 | 101 |
| 0.05 | 93 |
表6. hIgGを含むサンプルの精度
| 濃度（ng/ml） | 計算された コンク |
平均% 回復 |
|---|---|---|
| 1.2 | 1.08 | 90 |
| 1.0 | 0.91 | 91 |
| 0.8 | 0.74 | 92 |
| 0.6 | 0.54 | 90 |
| 0.4 | 0.35 | 87 |
| 0.2 | 0.19 | 93 |
| 0.1 | 0.11 | 106 |
| 0.05 | 0.06 | 125 |
定量限界（LoQ）
標準曲線から算出されたLoQは0.037 ng/mlでした。hIgG存在下でのrPA添加サンプルのLoQは0.102 ng/mlまたは0.82 ng/mg（0.82 ppm）でした。免疫グロブリン存在下でrPA50リガンドを検出する本キットの感度は、1 ppm（0.1万分のXNUMX）またはXNUMX ng/mL未満です。
希釈の直線性
図1。
希釈グラフの直線性は、テストされた濃度の範囲全体にわたって精度の高い相関関係を示しています。
結論
アッセイ内データは、標準曲線サンプルの精度が許容範囲内であり、% CV値が3.5～8.6%の範囲にあることを示しました。標準曲線から決定されたLoQは0.037 ng/mlでした。
アッセイ内データは、サンプルが相対的な正確性と精度で測定されたことを示しました。サンプルのLoQは0.102 ng/mlと算出されました。（プロテインA ELISAキットの感度は0.1 ng/mlです。）この限界値以上のサンプル濃度では、% CV値は10.4～2.6%で、15%の限界値を下回りました。
平均回収率で測定した精度は、標準の場合 93 ～ 101%、サンプルの場合 90 ～ 125% でした。
試験間データは、データの再現性を示しました。試験間の変動係数は、すべての標準濃度において4.9%以下でした。サンプルは試験間精度も高く、LoQ以上の濃度では%CV値が5.1～0.4%の範囲でした。
計算の説明
精度（%CV）
精度は、rPAを添加したサンプルデータポイント間の標準偏差を求め、平均値で割ることによって算出されました。「業界向けガイダンス：バイオ分析法バリデーション」のテキストによると、精度は15%以内である必要があります。
アッセイ内精度
すべてのアッセイの %CV 値を平均することにより、rPA を添加したサンプル濃度ごとにアッセイ内精度を計算しました。
アッセイ間精度
アッセイ間の精度は、3 つのアッセイそれぞれから計算された結果間の標準偏差を決定し、平均値で割ることによって各濃度ポイントで計算されました。
定量限界（LoQ）
定量限界（LoQ）は、10 ng/mlサンプルの標準偏差の0倍と定義されました。0 ng/ml OD値の標準偏差を10倍し、0 ng/ml OD値を基準値として加算しました。そして、その合計値を標準曲線の4パラメータ近似式に入力することで、LoQを算出しました。各キットのLoQは、緩衝液XNUMXmlあたりのngプロテインA（ng/ml）として、またhIgG存在下でrPAを添加したサンプルの場合はhIgG XNUMXmgあたりのngプロテインA（ppm）として報告されました。
検出限界（LoD）
検出限界（LoD）は、3 ng/mlプロテインAサンプルの標準偏差の0倍と定義されました。0 ng/ml OD値の標準偏差を3倍し、0 ng/ml OD値を基準値として加算しました。そして、その合計値を標準曲線の4パラメータ近似式に入力することで、LoDを算出しました。各キットのLoDは、緩衝液XNUMXmlあたりのプロテインA濃度（ng/ml）とppm（百万分率）で示されました。
精度
精度は、理論上の添加濃度と比較したアッセイによって決定された回収率として表される。