ソリューション
遺伝子治療プロセス分析
複雑なトランスフェクションワークフローと高価な材料を必要とする遺伝子治療では、特に上流工程において高い精度が求められます。REBEL®は、栄養素、代謝物、副産物をリアルタイムで追跡する高速なインライン培地分析を提供します。培地の性能を把握し、リアルタイムで条件を最適化し、オフラインラボでの分析を待つことなく開発を順調に進めることができます。あらゆる段階で、より高い制御性、より少ない遅延、そしてより大きな信頼性を実現します。
遺伝子治療の製造における複雑さを理解する
遺伝子治療製造におけるウイルスベクター
遺伝子治療は、遺伝性網膜疾患、脊髄性筋萎縮症（SMA）、鎌状赤血球貧血など、これまで治療不可能だった疾患を治療または治癒するために、患者の細胞内の遺伝物質を置き換えたり、挿入したり、削除したりするために使用される、急速に発展している生物学的治療薬の一種である。
細胞に遺伝物質を導入する方法はいくつかあるが、生体内での導入システムとしてウイルスベクターを用いる方法が業界で最も広く採用されている。ベクターの選択は、導入遺伝子の発現効率、製造の容易さ、および安全性によって決まる。
一般的に使用されるウイルスには、アデノウイルス（AV）、アデノ随伴ウイルス（AAV）、レンチウイルス（LV）、レトロウイルス（RV）などがある。
遺伝物質の生成
ウイルスベクターの製造は、複数の工程を含む複雑なプロセスです。通常、ウイルスベクターの製造に使用する遺伝物質の生成から始まります。使用される物質はベクターの種類によって異なり、プラスミドやヘルパー形質導入ウイルスなどが含まれます。
プラスミド（pDNA）は、大腸菌（E. coli）などの遺伝子組み換え細菌の発酵によって製造されます。このプロセスは一般的に単純ですが、適切な最適化を行わないと、プラスミドDNAの収量、構造、安定性が、効率的な商業規模のGMP製造に適さない場合があります。
微生物培養には、特殊な培地が必要となるだけでなく、発酵過程における重要なプロセスパラメータ（CPP）の綿密な監視と制御も必要となる。
宿主細胞へのトランスフェクションとベクター生成
次のステップでは、安定パッケージング細胞株、ヘルパーウイルス感染、または一過性トランスフェクションという3つの方法のいずれかを用いて、宿主細胞内でウイルスベクターを産生する。
Sf9などの昆虫細胞やその他の細胞種がウイルスベクターの生産に用いられることもあるが、ヒト胎児腎臓293（HEK293）細胞株がウイルスベクターの生産に最も広く用いられている。HEK293細胞は高いトランスフェクション効率を有し、アデノ随伴ウイルスやレンチウイルスなど様々な種類のウイルスベクターを生産でき、無血清培地での浮遊培養にも適応できる。
これにより、高い細胞密度が実現し、効率的なウイルス複製に適した糖鎖修飾パターンが得られる。
ウイルスベクター製造上流工程における共通の課題
ウイルスベクターベースの遺伝子治療のコストを削減し、安全性と有効性を向上させるために、上流のウイルスベクター製造プロセス（宿主細胞の増殖、トランスフェクション、およびウイルスベクターの生成）に関連するいくつかの課題に対処する必要があります。
- 接着培養から懸濁培養への細胞の適応とプロセスのスケールアップ
- 細胞培養中の凝集を最小限に抑えながら、高い細胞密度と細胞生存率を維持
- 高いトランスフェクション効率を達成するためのトランスフェクションプロトコルの最適化
- 高いウイルス力価の達成
- 完全なウイルスベクターカプシドと空のウイルスベクターカプシドの比率を高くする
ウイルスベクターの生産を最適化することは、細胞培養の過程、例えば細胞へのトランスフェクション後などに宿主細胞の代謝要求が変化するため、複雑になります。さらに、ウイルス複製は細胞の生理機能や代謝状態に大きな変化をもたらし、ウイルスの合成、組み立て、放出に影響を与えます。
培地開発や細胞培養パラメーターの動的な制御を通じて細胞代謝を理解し、調節することで、製造業者はウイルスベクターの力価を高め、カプシドの品質と遺伝子治療の効力を向上させることができる。
ウイルスベクターメディアの重要性
宿主細胞に必須栄養素を供給し、細胞の健全な増殖、効率的なトランスフェクション、高ウイルス力価の達成、およびプロセススケールアップを促進するためには、培養培地と供給戦略を開発し最適化する必要があります。細胞株の系統によって遺伝子発現プロファイルが異なり、トランスフェクション後や懸濁培養への適応後に代謝ニーズが異なる場合が多いため、培地の開発は各細胞株、ウイルスタイプ、および培養プロセスに合わせて調整する必要があります。
市販の培地は数多く存在するが、その組成や重要な成分の相対濃度は、販売業者やロットによって大きく異なる場合がある。さらに、トランスフェクション培地は高増殖には最適化されているものの、高ウイルス力価には最適化されていない場合があるため、生産培地の最適化がしばしば必要となる。
細胞代謝と、アミノ酸やグルコースなどの培地成分がウイルス力価に及ぼす影響を理解することは、生産性向上の鍵となる。
最適な増殖とウイルスベクター生産のために細胞に必要な栄養素を学ぶ
过程分析技术smart™ REBEL® XT 培地のスクリーニングと最適化を支援するツールを提供します。5つの異なるベンダーのHEK293培地は、栄養成分組成に大きな多様性を示しています。 開発作業を開始する際、多様なパネルをスクリーニングしているかどうかを把握していますか？また、これらのメディアに開発プロセスにとって重要な要素が含まれているかどうかをどのように判断していますか？
例えば、ナドーの研究では らアスパラギン（Asn）の役割は、HEK293におけるアデノウイルスのビリオン形成に重要であることが指摘された。1ここでテストしたメディアのパネルでは、分析した5つのメディア間でAsnが大きく異なります。 レブルXT.
自律的AI レブルXT、パネル内のメディアの構成に関する実用的な洞察が得られ、それによって多くの結果が説明できるようになります。
メディアとフィードの開発を加速し、市場投入までの時間を短縮
最適な培地配合と給餌戦略を開発するには、細胞の増殖、トランスフェクション、ウイルスベクターの生成を通じて主要な栄養素の濃度を頻繁に監視する必要があります。
細胞培養培地の分析結果を数週間待つことは現実的ではありません。 レブルXT 迅速な分析処理時間、少量のサンプル、最小限のサンプル準備を実現するソリューションを提供します。
ウイルスベクターの品質を保つには、より明確に定義された動物由来成分を含まない、化学的に定義された培地を使用した無血清生産が必要です。
AAV 製造およびレンチウイルス製造のための効率的なウイルスベクター製造は、遺伝子治療製造の重要な要素です。
より多くの細胞治療および遺伝子治療が FDA の承認に進むにつれて、プラスミド DNA の生産性を高めるために現在の製造プロセスを拡大することが不可欠になります。
遺伝子治療における市場の需要を満たすには、ウイルスベクター生産のスケールアップを改善する必要があります。
リアルタイム監視によるプロセスの堅牢性の確保
pH、溶存酸素、温度といった物理化学的変数のリアルタイム監視と制御は細胞培養プロセスにおいて確立されていますが、最適化されたウイルスベクター製造プロセスの開発と維持には十分ではありません。バイオリアクターの種類や操作モード（フェドバッチ法またはパーフュージョン法）に関わらず、継続的な監視とリアルタイムプロセス制御は、生細胞密度の向上、ウイルス力価の向上、トランスフェクションの最適化、培地使用量の削減、毒性副産物の削減など、遺伝子治療薬の製造におけるいくつかの重要な目標の達成に役立ちます。
細胞増殖、トランスフェクション、ウイルスベクター生産中の重要なプロセスパラメータ (CPP) をリアルタイムで監視することで、プロセスの理解が深まり、より堅牢なプロセスモデルの開発がサポートされ、最適化された基質供給および培地交換戦略の開発と実装が可能になります。
細胞の主要なエネルギー源であるグルコースは、必要な栄養素を供給し、細胞ストレスを回避するために、細胞培養期間を通して最適な濃度に維持されなければなりません。細胞の栄養要求量は、培養およびウイルスベクター産生の各段階を通して一定ではありません。栄養要求量は、細胞増殖の段階によって変化し、トランスフェクションやウイルスベクター産生の影響を受けます。継続的なモニタリングによる厳密なグルコース制御を行わないと、グルコース濃度が変動し、細胞代謝が不安定化して細胞ストレスを引き起こし、ウイルスベクター産生に悪影響を及ぼします。
グルコース濃度が最適値に満たない場合、感染性、遺伝子発現レベル、ベクターの安定性といったベクター特性にばらつきが生じる可能性があります。グルコース濃度を厳密に制御することで、再現性のある高品質のウイルスベクターを安定的に生産できます。グルコース濃度をリアルタイムでモニタリングすることで、培地の供給と交換を動的に制御することが可能になり、生産性を損なうことなく培地と供給量の使用量を最大60%削減できます。2.
グルコースに加えて、乳酸も継続的にモニタリングする必要がある重要なパラメータです。乳酸の蓄積は細胞内の代謝ストレスを示唆し、ウイルスベクター産生能力を低下させる可能性があります。さらに、乳酸の蓄積は培地pHの低下を招き、細胞の増殖、生存率、そして産生されたウイルスベクターの安定性に悪影響を及ぼす可能性があります。
総細胞数と相関するリアルタイムの総バイオマス測定は、ウイルスベクター製造の一貫性と効率性を確保するために不可欠です。総バイオマス情報は、予想される細胞増殖軌道からの逸脱を特定し、プロセスパラメータを規定の動作範囲内に維持するのに役立ちます。プラスミドDNAを正常に取り込む細胞の割合であるトランスフェクション効率は細胞密度の影響を受けるため、リアルタイムの総細胞数情報はトランスフェクションプロトコルの最適化に活用できます。
トリプルトランスフェクションプロセスの成功は、細胞培養における主要なパラメータの最適化と、フィーディング戦略の改良にかかっています。グルコースや乳酸といった重要なパラメータは、細胞生存率、トランスフェクション効率、ウイルスベクターの力価と品質に影響を与えるため、細胞培養プロセス中は綿密に監視・管理する必要があります。
[2] ヴァルカマ AJ、レイノネン HM、リッポネン EM、トゥルキ V、マリネン J、ヘイクラ T、イラ・ヘルトゥアラ S、レッシュ HP。固定床バイオリアクターにおけるスケールアップのためのレンチウイルスベクター生産の最適化。遺伝子治療。 2018年25月XNUMX日
リアルタイム監視によるプロセスの堅牢性の確保
pH、溶存酸素、温度といった物理化学的変数のリアルタイム監視と制御は細胞培養プロセスにおいて確立されていますが、最適化されたウイルスベクター製造プロセスの開発と維持には十分ではありません。バイオリアクターの種類や操作モード（フェドバッチ法またはパーフュージョン法）に関わらず、継続的な監視とリアルタイムプロセス制御は、生細胞密度の向上、ウイルス力価の向上、トランスフェクションの最適化、培地使用量の削減、毒性副産物の削減など、遺伝子治療薬の製造におけるいくつかの重要な目標の達成に役立ちます。
細胞増殖、トランスフェクション、ウイルスベクター生産中の重要なプロセスパラメータ (CPP) をリアルタイムで監視することで、プロセスの理解が深まり、より堅牢なプロセスモデルの開発がサポートされ、最適化された基質供給および培地交換戦略の開発と実装が可能になります。
細胞の主要なエネルギー源であるグルコースは、必要な栄養素を供給し、細胞ストレスを回避するために、細胞培養期間を通して最適な濃度に維持されなければなりません。細胞の栄養要求量は、培養およびウイルスベクター産生の各段階を通して一定ではありません。栄養要求量は、細胞増殖の段階によって変化し、トランスフェクションやウイルスベクター産生の影響を受けます。継続的なモニタリングによる厳密なグルコース制御を行わないと、グルコース濃度が変動し、細胞代謝が不安定化して細胞ストレスを引き起こし、ウイルスベクター産生に悪影響を及ぼします。
グルコース濃度が最適値に満たない場合、感染性、遺伝子発現レベル、ベクターの安定性といったベクター特性にばらつきが生じる可能性があります。グルコース濃度を厳密に制御することで、再現性のある高品質のウイルスベクターを安定的に生産できます。グルコース濃度をリアルタイムでモニタリングすることで、培地の供給と交換を動的に制御することが可能になり、生産性を損なうことなく培地と供給量の使用量を最大60%削減できます。2.
グルコースに加えて、乳酸も継続的にモニタリングする必要がある重要なパラメータです。乳酸の蓄積は細胞内の代謝ストレスを示唆し、ウイルスベクター産生能力を低下させる可能性があります。さらに、乳酸の蓄積は培地pHの低下を招き、細胞の増殖、生存率、そして産生されたウイルスベクターの安定性に悪影響を及ぼす可能性があります。
総細胞数と相関するリアルタイムの総バイオマス測定は、ウイルスベクター製造の一貫性と効率性を確保するために不可欠です。総バイオマス情報は、予想される細胞増殖軌道からの逸脱を特定し、プロセスパラメータを規定の動作範囲内に維持するのに役立ちます。プラスミドDNAを正常に取り込む細胞の割合であるトランスフェクション効率は細胞密度の影響を受けるため、リアルタイムの総細胞数情報はトランスフェクションプロトコルの最適化に活用できます。
トリプルトランスフェクションプロセスの成功は、細胞培養における主要なパラメータの最適化と、フィーディング戦略の改良にかかっています。グルコースや乳酸といった重要なパラメータは、細胞生存率、トランスフェクション効率、ウイルスベクターの力価と品質に影響を与えるため、細胞培養プロセス中は綿密に監視・管理する必要があります。
[2] ヴァルカマ AJ、レイノネン HM、リッポネン EM、トゥルキ V、マリネン J、ヘイクラ T、イラ・ヘルトゥアラ S、レッシュ HP。固定床バイオリアクターにおけるスケールアップのためのレンチウイルスベクター生産の最適化。遺伝子治療。 2018年25月XNUMX日
アミノ酸は細胞の機能と生存に不可欠ですが、細胞によって消費速度は異なります。細胞増殖中のアミノ酸濃度をモニタリングすることで、バッチの不具合につながる可能性のあるアミノ酸の枯渇を防ぐことができます。
グルコースは主要なエネルギー源であり、培地中のグルコース濃度は代謝経路を制御し、増殖、代謝産物の産生、そして表現型の発現と関連しています。グルコースの連続測定は、基質供給ポンプや培地交換ポンプの制御に利用できます。
乳酸の過剰な蓄積は細胞の成長を阻害し、サイトカイン分泌を減少させる可能性があります。また、細胞数の推定、細胞増殖率の予測、最適な収穫時期の決定にも利用できます。
特に細胞数の計測が難しい接着細胞培養においては、適切な細胞密度が確保されていることを確認してください。
ウイルスベクター生産の究極の監視と制御のための選択肢
当社のデバイス スイートは、必要なデータを必要なときに必要な場所で提供します。
細胞治療ワークフローにプロセス分析技術（过程分析技术）を導入する
歴史的に、自動化された細胞療法製造システムでは、堅牢で互換性のあるプロセス分析技術が不足していたため、リアルタイム監視機能が限られていました。 过程分析技术smart™ MAVEN® and 过程分析技术smart™ マーベリック® さまざまな使い捨ておよび再利用可能なプロセス インターフェイスと、複数のアナログおよびデジタル通信オプションが提供され、多数の製造自動化システムとの統合が可能になります。
过程分析技术smart™ REBEL® XT アットラインメディアアナライザー
細胞培養培地のアットライン分析
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